Electroforese en PCR

Chemisch algemeen, Snuffelstage bij Enza zaden

Hoofdstuk 1 Het Stage bedrijf

Enza zaden is opgericht in 1938 (begonnen onder de naam De Enkhuizer Zaadhandel) door Jacob Mazereeuw. In 1959 is Enza begonnen met de eerste zadenkweek en kruisbestuivingen
Enza zaden is in 1989 gestart met moleculaire biologie en geavanceerd fytopathologisch onderzoek. In hetzelfde jaar is Keygene in Wageningen opgericht met het doel zich te specialiseren in moleculair, biologisch onderzoek (Enza zaden is aandeelhouder van Keygene). Alle technologieën en onderzoeksresultaten worden doorgestuurd naar Enza’s verdelingstations in Frankrijk, Spanje, Turkije, Amerika en hun jointventure in Indonesië. Op deze plaatsen wordt het in verdere implementatie gebracht.

[plaatje0]

Er zijn verschillende afdelingen bij enza zaden:

· cel- en weefselkweek
· Celbiologie
· Moleculaire biologie
· Fytopathologie
· Biochemie

Op de afdeling Cel- en Weefselkweek richt men zich op de realisatie van doelstellingen binnen meerdere groentegewassen met betrekking tot:
· in vitro (buiten de plant/ organisme) instandhouding en vermeerdering van elite plant materiaal
· Ontwikkeling van verdubbelde haploïde (2 strengen van dezelfde DNA) lijnen in vitro (dit zijn planten voorkomend uit voortplantingscellen: stuifmeel en eicellen) van verschillende groentegewassen ten behoeve van versnelling van de verdelingsprogramma’s
· Verbreding van genetische variatie van verschillende groentegewassen met behulp van diverse in vitro technieken

Op de Afdeling Celbiologie houden ze zich bezig met 2 belangrijke thema’s
· Ontwikkeling van genetische transformatietechnologie en productontwikkeling met betrekking tot de genetische modificatie van groentegewassen
· Introductie van nieuwe nucleair of cytoplasmatisch gecodeerde eigenschappen in verschillende groentegewassen door middel van celfusie (protoplast) technologie

Op de afdeling moleculaire biologie houden ze zich bezig met onderzoeken die de volgende twee punten omvatten
· ondersteuning van verdelingsonderzoek met behulp van verdelingsonderzoek met behulp van diverse types moleculaire merkers
· Ontwikkeling van moleculaire technologie die kan worden toegepast bij de genetische modificatie van groentegewassen

Op de afdeling fytopathologie wordt in het fytopathologisch onderzoek gericht op de ziekteverwekkers of plaag zelf (virus, bacterie schimmel, insect, ect.) en onderzoek met betrekking tot de relatie tussen ziekteverwekker en het groentegewas. De ontwikkeling en implementatie van ziektetoetsen en identificatie van nieuwe resistentiebronnen binnen groentegewassen zijn belangrijke doelstellingen van het fytopathologisch onderzoek

Op de afdeling Biochemie worden biochemische technieken toegepast bij de analyse en/of identificatie van specifieke verbindingen die betrokken zijn bij smaak, eventuele toxiciteit, resistentie tegen ziekteverwekkers of overige belangrijke eigenschappen.

Ook is er een afdeling plantveredeling deze is onderverdeeld in gewasgroepen,te weten:

Vruchtgewassen
Bladgewassen
Koolgewassen
Knol- en wortelgewassen

Hoofdstuk 2 De theoretische achtergronden van PCR en Elektroforese.

Het principe van PCR.

De afkorting PCR betekent Polymerase Chain Reaction ofwel Polymerase Ketting Reactie. De polymerase ketting reactie is gebaseerd op de eigenschap van DNA-kopiërende enzymen om stabiel te blijven bij hoge temperaturen. De Thermus aquaticus is een bacterie uit Yellowstone National Park die overleefde in een hete bron en de aanzet was tot de laboratoriumtechniek de PCR. Deze bacterie helpt onderzoekers nu om miljoenen kopieën van een enkele DNA-fragment te maken in slechts een paar uur.

De PCR imiteert het proces uit de natuur waar bij bijna alle organismen het dupliceren van DNA op dezelfde manier plaatsvindt.
Om DNA te kopiëren heeft polymerase nog twee andere componenten nodig: een oplossing van de vier nucleotide basen en een primer. DNA polymerasen kunnen geen streng kopiëren zonder primer. Hierom bevat de cel nog een enzym, genaamd primase, dat van de eerste nucleotide basen een kopie maakt. Dit kleine stukje DNA is de primer.

Een PCR buisje bevat alle benodigde bestanddelen voor DNA-duplicatie: een stuk DNA, grote hoeveelheden van de vier nucleotide basen, grote hoeveelheden van de primer en DNA polymerase. De polymerase is de Taq-polymerase, vernoemd naar Thermus aquaticus, waaruit de polymerase is geïsoleerd.

De drie fasen van de PCR vinden plaats in hetzelfde reactiebuisje, maar bij verschillende temperaturen:
· De eerste fase van het proces is het scheiden van de DNA-strengen in de dubbele helix. Dit wordt gedaan door de buis te verhitten tot 90-95 °C gedurende 30 seconden.
· De tweede fase is het binden van de primers aan de DNA-streng, deze reactie vindt plaats bij 55 °C gedurende 20 seconden.
· De laatste fase van het proces is het maken van een complete kopie van de DNA-streng. Omdat de Taq-polymerase het beste werkt bij 75 °C wordt de temperatuur van de buis verhoogd.
De Taq-polymerase begint met het toevoegen van de vier nucleotide basen aan de primer en maakt uiteindelijk een complete kopie van de DNA-streng. Dit is 1 ronde van de PCR.
De drie stappen van de PCR vinden plaats in slechts twee minuten.
De ronden kunnen 30 of meer keer herhaald worden. Dus na 30 ronden kunnen een miljard kopieën gemaakt worden van een enkele DNA-fragment.

De PCR is waardevol voor onderzoekers omdat het hen in staat stelt om unieke delen van het DNA te dupliceren. Onderzoekers in de Human Genome Project gebruiken PCR om te zoeken naar markers in gekloonde DNA-segmenten en DNA-fragmenten te rangschikken.

Schematische weergave van PCR

De PCR is een drie stapsproces dat tientallen malen herhaald wordt en een exponentiële vermeerdering va specifiek DNA bewerkstelligt. Een cyclus is boven in detail getekend (plaatje ontbreekt, red). Het bovenstaande schema stelt 1 cyclus voor.
Bij de denaturatie laat het dubbelstrengs-DNA los en vormt twee enkele strengen. Dit gebeurt bij een temperatuur van 92oC.
Hierna daalt de temperatuur tot 36 oC. Als de temperatuur op 36 oC is dan stijgt deze langzaam en haakt de primer vast. Dit tot deze op 60 oC is. Daarna stijgt de temperatuur verder tot 72 oC. Bij deze temperatuur verlengen de ketens zich.

Het principe van elektroforese.

Elektroforese is een scheidings methode. Van deze Scheidings methode zijn veel verschillende variaties. Enkele voorbeelden zijn, Zone-elektroforese, Polcrylaidegel-elektroforese, Immuno-elektroforese, Preparatieve elektroforese en elektroforese van nucleïnezuren. Deze verschillende soorten gaan we niet allemaal behandelen.

Om te beginnen iets over de geschiedenis van elektroforese. De eerste elekctroforetische experimenten werden begin 18de eeuw uitgevoerd (1809) De fisicus die deze experimeten uitvoerde heette Reuss, deze man bestudeerde het verplaatsen van colloïdale deeltjes. Hierbij ontdekte hij ook elektro-endosmose. De naam van elektroforese kwam echter pas een eeuw later.
Deze naam werd door Michaelis geïntroduceerd. Michaelis bepaalde met deze methode de isoëlectrische punten van invertase en katalase. Omstreeks 1930 ontwikkelde Tiselius de vrije of moving boundary elektroforese, waarmee een vooruitgang werd geboekd in analytisch opzicht. Tiselius werd hiervoor beloond met de nobelprijs.

Het basisprincipe van elektroforese

De elektroforese lijkt in enkele opzichten op chromatografie. Elektroforese is een scheidingstechniek die onder spanning plaats vindt. Zowel bij elektroforese als chromatografie worden deeltjes gescheiden door middel van hun eigen bewegingstempo in een vloeistof. Dit bewegen noemt men in de elektroforese migreren. Veel verder dan de eenvoudige uitvoering van elektroforese gaat de vergelijking niet.
Voor de beweging van de deeltjes is een kracht nodig, deze wordt in en spanningsveld veroorzaakt door het aansluiten van een gelijk spanningsbron op het analyse materiaal. Deze gelijkspanning kan liggen tussen 100 V maar ook 1000 V of zelfs nog meer volts. De te scheiden deeltjes moeten natuurlijk wel een lading hebben. Elektroforese is daarom een scheidingsmethode die uitstekend geschikt is voor de scheiding van deeltjes met een karakteristieke eigenschap. Zulke componenten zijn: aminozuren, eiwitten en andere biologisch belangrijke deeltjes zoals kernzuren (DNA, RNA en nucleïnezuren). In tegenstelling met de chromatografie maakt de ‘stationaire fase’ van het monster niets uit. In principe zou je elektroforese ook in een oplossing kunnen uitvoeren. Dit wordt vrije elektroforese genoemd. Het nadeel is dat de gescheiden componenten moeilijk te isoleren zijn. Het gebruik van een drager ofwel een matrix is hierbij handig. Deze drager heeft als doel het vast houden van de vloeistof. Het materiaal van de drager kan zijn: papier, cellulose, agarose(een koolhydraat) of gelatineuze kunststoffen.

Stel dat er een experiment wordt uitgevoerd met papier als drager. De opstelling zou er dan zo uitzien.

[plaatje1]

In een elektroforeseruimte bevinden zich twee vloeistof reservoiren. Deze bakken zijn gevuld met bufferoplossing. De ene bak is negatief van lading(kathode) en de andere bak is positief van lading(anode) Tussen deze bakken is de drager gespannen. De drager hangt met de beide randen in de bufferoplossing. Deze drager is doordrenkt met de bufferoplossing. Op deze drager wordt het monster aangebracht. Dit gebeurt in het midden en dwars over het papier. Op de deeltjes werkt na aansluiting van de spanningsbron een elektrische lading. De deeltjes met een negatieve lading migreren naar de positieve kant en de positief geladen deeltjes migreren naar de negatieve kant.
Wanneer een deeltje snelheid krijgt, zal deze ook wrijvingskracht op het deeltje werken. Bij het bereiken van een bepaalde snelheid zullen beide krachten(Elektrische- en wrijvingskracht) met elkaar in evenwicht zijn.

De grootte van de elektrische kracht is evenredig aan de elektrische veldsterkte:

Fel = E . q

Fel = elektrische kracht (N)
E = Elektrische veldsterkte (V/m)
q = lading (C)

De wrijvingskracht die op een deeltje werkt is ook weer evenredig aan de snelheid die het deeltje ontwikkeld.

Fw = f . v

Fw = wrijvingskracht op het deeltje (N)
f = wrijvingscoëfficiënt (N.s/m)
v = snelheid van het deeltje (m/s)

De wrijvingscoëfficiënt hangt af van een aantal factoren. Deze factoren zijn de grootte van het deeltje en de viscositeit van de vloeistof waar de deeltjes in zitten. Voor de berekening van de wrijvingscoëfficiënt gaan we er voor het gemak van uit dat het deeltje bolvormig is.

f = 6 . r . π . η

r = straal van het deeltje
η = viscositeit van de gebruikte vloeistof.

Wanneer tijdens de beweging van de deeltjes de elektrische kracht en de wrijvingkracht gelijk, dan is er een evenwicht ontstaan tussen deze twee krachten. Het deeltje beweegt eenparig. Deze migratie is karakteristiek voor het deeltje en de scheiding ervan.
Bij constante snelheid van het deeltje geldt dus voor de grootte van de krachten:

Fel = Fw

Met substitutie van gegeven relaties:

6 . r . η . π . v = E .q

hieruit kun je afleiden:

v = E . q .
6 . r . η . π

De bovenstaande vergelijking geeft een beeld van hoe de snelheid van het geladen deeltje afhangt van de elektrische kracht, lading, grootte van het deeltje en de viscositeit van de gebruikte vloeistof. Een meer gebruikelijke benaming voor de mobiliteit van het deeltje, is de snelheid per eenheid van veldsterkte:

m = v/E = q .
6 . r . η . π

m = mobiliteit van het deeltje (m2/V . s)

helaas zijn de ladingtoestand en de afmeting van het deeltje en de viscositeit van de oplossing niet constant. Er zijn verschillende experimentele omstandigheden die van invloed zijn op de besproken grootheden.

De experimentele omstandigheden

Wat is er van invloed op de experimentele omstandigheden.
§ Afmeting
§ Diffusie
§ Temperatuur
§ Zuurgraad
§ Elektro-endosmose

Afmeting:

De afmeting van het deeltje is van invloed omdat een migrerend deeltje een weerstand ondervindt. Hoe groter de afmetingen van het deeltje, hoe groter de wrijvingskracht op dit deeltje en dus meer weerstand. Ook vormen geladen deeltje een watermantel, deze watermantel maakt het deeltje ook nog weer groter dus wordt de weestand weer groter, daardoor neemt de snelheid van de migratie af. De dikte van deze watermantel hangt weer af van de mogelijkheden van het deeltje om waterstofbruggen te kunnen vormen.

Diffusie:

Diffusie heeft een belangrijke invloed op de kwaliteit van de scheiding. De maat van de diffusie is weer afhankelijkheid van temperatuur.

Temperatuur:

Doordat elektroforese bij een hoge gelijkspanning wordt uitgevoerd, kun je niet vermijden dat er stroom loopt, en dus komt er bij elektroforese warmte vrij.
Deze warmte ontwikkeling door de elektrische stroom is afhanglijk van de stroomsterkte en de spanning:

Q = V . I . t (J)

Deze warmte ontwikkeling heeft voor het scheidingsproces een aantal nadelen. Als eerste kunnen de te analyseren deeltje van eigenschap veranderen door de warmte. Bijvoorbeeld het denatureren van eiwitten, hierbij veranderd de confirmatie en krijgt dus een ander gedrag in een oplossing.
Een ander nadeel is dat de diffusie snelheid ook toeneemt. En dus ook toename van ongewenste vloeistofstromen(convectie). Dit verschijnsel doet zich vooral voor als de stijging van temperatuur niet constant is. Veel van de analyses met behulp van elektroforese vinden dan ook plaats in een gekoelde elektroforesekamer.

[plaatje2]

Zuurgraad

Ook de pH van de oplossing is van invloed op de elektroforese. Dit heeft te maken met dat de ladingstoestand van de deeltjes nauw samenhangt met de pH. Een voorbeeld van zo'n deeltje is het aminozuur glycine. Bij een lage pH is dit aminozuur positief geladen en bij een hoge pH is dis deeltje negatief geladen. En in het iso-elektrische punt (IEP) is de gemiddelde lading dus neutraal.
Deze verschillen in ladingstoestand gelden ook voor andere deeltjes die van biologische oorsprong zijn. Ook heeft de pH als tweede invloed dat ook bij extreme pH het eiwit de quarternaire structuur kan verliezen.

Elektro-endosmose

De oplossing waarin de elektroforese plaats vindt, is niet elektrische exact neutraal. Dat komt doordat er van het dragermateriaal ionen vrijkomen, en daarvoor in de plaats komen tegenionen. Bij veel van de dragermaterialen komt dit verschijnsel een beetje voor. In die gevallen is er een overschot aan gehydrateerde positieve ionen. De elektrische stroom die in de oplossing loopt wordt door het totaal aan ionen dat het elektrische veld beweegt. Aangezien de bijdrage van de positieve ionen aan deze geleiding iets groter is dan die van de negatieve, is het meesleepeffect dat de bewegende ionen veroorzaken, het sterkst in de richting van de negatieve pool.
Kort gezegd: de vloeistof verplaatst zich iets in de richting van de negatieve pool. Ook neutrale deeltjes zullen hierdoor iets verplaatsen. Het verschijnsel heet elektro-endosmose of op zijn engels electro-osmotic flow

Gel -elektroforese.

Oorspronkelijk werd elektroforese met papier uitgevoerd tegenwoordig zijn er ook verschillede gels verkrijgbaar waarmee nauwkeuriger kan worden voldaan aan de vereiste omstandigheden voor een scheiding.
Deze omstandigheden kunnen zijn: de maat waarin elektro-endosmose optreedt, de maat waarmee absorptie optreedt, poriëngrootte, pH-regulering in de gel, oplosbaarheid van de componenten na scheiding en de mogelijkheden van detectie.
Een belangrijk voordeel is bijvoorbeeld het feit dan een gel transparant is, waardoor na kleuring van de gescheiden eiwitten door middel van densiteitmeting kwantitatieve bepalingen kunnen worden verricht.

Cellulose-acetaat

Cellulose acetaat is cellulose waarvan de hydroxygroepen zijn veresterd met ethaanzuur. Het materiaal dat zo ontstaat kan nog zeer hydrofiel zijn terwijl de absorptie van componenten als gevolg van waterstofbindingen sterk is verminderd Het materiaal is volkomen transparant en wordt mede daarom gebruikt voor de routine-analyse van eiwitten in bloedserum.

Agarose

Agarose ofwel agar is een polysacharide die wordt verkregen uit zeewier. Ook agarosegels worden kant en klaar geleverd en toegepast voor de routine-analyse van eiwitten in bloedserum.

[plaatje3]

De afbeelding laat het resultaat van de elektroforese van enkele sera zien. Elk donker bandje stelt een eiwit of een eiwitgroep voor. Het eiwitpatroon (eiwitspectrum) kan nog beter zichtbaar worden gemaakt door middel van meting met een densitometer.

[plaatje4]

In bovenstaande afbeelding is een is het signaal van een densitometer te zien. Elke piek stelt een eiwitgroep voor. Extra eiwitbanden of veranderingen van het profiel hangen samen met allerlei ziekten.

Schematische weergave van Elektroforese.

[plaatje5]

Toepassing van PCR + elektroforese

Een toepassing van PCR

De PCR wordt uitgebreid gebruikt in het kader van onderzoek, maar ook steeds meer voor het bepalen van ziekten. De grote kracht van de PCR is de gevoeligheid. Deze gevoeligheid houdt echter ook tegelijk de zwakte in: geringe verontreinigingen kunnen tot foute uitslagen leiden. Om verontreinigingen te voorkomen, moet tijdens de verschillende fasen van de test in aparte ruimten worden gewerkt. Daarnaast is er speciale apparatuur nodig. Naast het aantonen van micro-organismen (virussen en bacteriën) en het aantonen van erfelijke ziekten, wordt de PCR ook gebruikt voor onderzoek op archeologische monsters. DNA is erg stabiel en kan duizenden jaren goed blijven. Zo kan de PCR worden uitgevoerd op weefsels van mummies die zijn gevonden in de piramides van Egypte. Nu, duizenden jaren later, kunnen we met behulp van de PCR vaststellen waaraan deze mensen zijn overleden.

Toepassing van elektroforese.

Een toepassing van elektroforese is het vergelijken van DNA van slachtoffers, gevonden sporen en van verdachten.
Een andere toepassing wordt op het bedrijf toegepast. En dat is bekijken of een bepaald gen voor een bepaalde eigenschap van een plant homozygoot of heterozygoot is. Hiermee willen ze bekijken of een plant de gewenste eigenschappen heeft.

Wat hebben elektroforese en PCR nu met elkaar te maken.

Bij PCR vermenigvuldig je de DNA structuur van bijvoorbeeld het gevonden spoor, en dus kun je daarmee meerdere uitlopers laten maken met behulp van elektroforese. Deze manier wordt ook in het bedrijf Enza zaden toegepast.
Ook een toepassing wordt uitgelegt in de bijlage .

Hoofdstuk 3 De snuffelstage

Programma voor deze dag.

Kennis maken met de stagebegeleider
Inleidend verhaal over het bedrijf zelf
Een verhaal over wat er in het laboratorium wordt gedaan.
Rond leiding door het bedrijf.
Laboratorium
Eerste deel: weefselkweek
Tweede deel: moleculaire celbiologie(de afdeling van Ilse)
Kassen
Rondleiding door de kassen
Stagewerk van Ilse bekijken
PCR bekijken
Electroforese bekijken

Analyse resultaten
In verband met dat we niet zelf een proef hebben uitgevoerd hebben we niet echt veel resultaten
We hebben wel 2 uitdraaien van een elektroforese

Een dagje snuffelen bij Enza Zaden

Om 9 uur waren wij bij Enza Zaden. Toen we binnenkwamen werd er koffie en thee gepakt en gingen we samen met Nanne en Ilse naar een kleine vergaderzaal.

Aldaar werden we ingelicht over het doen en laten van Enza zaden en waar ze allemaal in de wereld zitten en hun verschillende zusterbedrijven en jointventures.

Enza Zaden verkoopt zaden (deze worden gewonnen uit gewassen die bij wat dochterbedrijven worden gekweekt), en de planten worden in het gedeelte waar Ilse stage loopt gekruist om betere plantsoorten te krijgen waardoor de zaden van dat ras meer waar zijn.

Op traditionele wijze kost het kruizen van planten heel veel tijd en daarom versnellen ze het proces in het laboratorium. De wijze van kruizen op de traditionele wijze wordt ook nog toegepast dit gebeurt echter niet bij Enza zaden maar bij de Enza-dochter Vitalis.

De zaden die in het laboratorium worden gekruist moeten nog getest worden in de praktijk. Daarom heeft Enza Zaden ook een kassen complex. In dit complex worden de gekruiste planten gekweekt en er wordt gekeken of de eigenschap waarvoor ze gekruist zijn aanwezig is bv. een plant word behandelt om een bepaald virus te weerstaan. Om dit te testen dompelen of smeren ze de plant in met een oplossing die dit virus bevat en er wordt tijdens de groei gekeken of ze er tegen kunnen.

Hierna gingen we een kijkje nemen in de laboratoria van Enzo zaden. Het is in feite in tweeën gedeeld het ene deel is vreselijk steriel en het andere deel totaal niet.

In het steriele gedeelte doen ze weefselkweek en daar werken ze in vlokasten zodat het weefsel niet besmet wordt met een virus dat ze niet willen omdat ze dan niet meer kunnen zien of de plant wel of niet resistent zijn met het virus waarmee het weefsel is bestemd.

Aan de niet steriele kant doen ze de kruisingen en bekijken ze welke plant welke eigenschap bezit. Dit is de kant waar Ilse werkt de afdeling moleculaire celbiologie.

Na de rondleiding gingen we pauze houden. In de pauze werd er veel gepraat over hoe de opleiding nu in elkaar zit en welke richting we doen.
Na de pauze gingen we naar de kassen van Enza zaden. Deze kassen waren duidelijk verdeeld in 2 delen. Een deel waar de planten in quarantaine opgroeide onder invloed van een ziekte verwekker. Ook werden de planten zonder invloed van mensen opgegroeid. De uitlopers en dergelijke konden gewoon hun gang gaan. Het verschil tussen planten met het goede gen en planten die het niet hebben is goed te zien. De planten die wel de goede genen hebben zien er mooi groen en gezond uit, dat in tegenstelling tot de planten die de genen niet hebben. Deze planten hebben vaak dorre of bruine bladeren. Het opvallende hierbij is dat de ziekte planten vaak wel bloemen hebben. Nanne vertelde ons dat planten dit doen omdat ze zich willen voortplanten alvorens zij aan de ziekte bezwijken.

In de kassen hebben ze ook een groot aantal verschillende planten o.a. komkommers, sla, spruiten, tomaten, paprika ect..
Er is alleen 1 verschil tussen de kassen van Enza en die van een tuinder. Bij Enza laten ze de groenten schieten want dan worden zaden gevormd iets wat een tuinder niet zal doen want dan kan hij het niet meer verkopen.

In het andere deel van de kassen worden de planten opgegroeid zoals de tuinder dit ook zou doen. Dit op te kijken hoe een plant er dan uit gaat zien.

Na de rondleiding door de kassen liet Ilse ons haar werk zien en vertelde wat ze deed, een onderzoek naar de indificatie van komkommerrassen door middel van hun genen, en hoe ze dat deed. Na een uitleg over hoe DNA gekopieerd wordt in de PCR machine laat ze zien hoe je het DNA kleurt.

Na de kleuring mochten wij het DNA overpipeteren in de slotjes in de gel voor de elektroforese. Het overpipeteren gebeurde met een 12 mondige pipet dus dat ging lekker snel. Daarna zette Ilse het apparaat aan en liet ons zien wat er na de elektroforese met de gel gebeurt. De gel gaat dan eerst in een bad om te kleuren en daarna werd het overgeschept in een fotoapparaat en maakt men er foto's van. Dit hebben wij ook gedaan en hebben er ook twee uitdraaien van mee deze hebben we bijgevoegd in het verslag. Na dat Ilse ons haar werk had laten zien waren we klaar en werden we door Nanne naar het station gebracht.